上一篇讲到核提取物。实验的下一步就是跑Sephacryl S-300 column。
这一步实验是整个课程中第一次跑凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography)，
我感觉还是很激动的。Gel filtration 是色谱中及其重要的一个种类。我先来谈谈
原理把。Gel filtration柱的材料是由高分子聚合物做的微珠。这些微珠呢，并不是
实心的，而是有很多孔状结构。当蛋白质样品经过这些微珠的时候，如果蛋白质分
子体积太大，不能通过微珠的孔状结构，就会绕过微珠，很快的被洗脱下来。如果
蛋白质分子体积不是那么大，可以通过微珠的孔状结构，就会迟一些被洗脱下来。
这样，蛋白质分子可以根据大小而被gel filtration column分开。
Gel filtration 和其他色谱方法一个显著的不同是：Gel filtration 并不依赖
蛋白质分子与柱材料的结合来分离蛋白。这个特点的一个好处是，所有的蛋白样品
最后都能被洗脱下来，柱子重复用也不会有什么问题。但是这个特点也给Gel filtration带来了一个严重的缺陷：低分辨率。分辨率包括两个因素，一个是两个蛋白峰的距离，另一个是，蛋白峰的宽度。由于蛋白在gel filtration column里面并不与柱材料相互结合，所以很容易扩散(diffusion)，扩散的结果就是蛋白峰非常宽。这个宽度非常要命，很多时候即使用了很好的柱子，蛋白顶峰也大致能分开, 但是由于蛋白峰太宽，重叠在一起，这样就很难分干净。另外，两个不同大小蛋白的洗脱体积的差别与分子量差别的对数呈线性关系，所以可以想见，如果分子量相近（比如只差两三倍）的话，洗脱位置也会相近，Gel filtration是很难把两个蛋白完全分开的。
说一件我的糗事。有一次一个师妹遇到了一个难题，表达一个GST-tagged的蛋白
有一个降解产物。她想要的蛋白50kD,而那个降解的产物有30KD。她问我该怎么分开。我没仔细想，就告诉她用Gel filtration。现在想起来，这实在是个昏招。当然，欣慰的是，该师妹最终没有试gel filtration, 用别的方法解决了这个问题。:-)
如果要想蛋白峰宽度变窄一点，怎么办呢？就样品而言，体积越小越好，理想状况是小于柱体积的２％。就柱子的材料而言，最主要的就是得把微珠做小一些，这样空体积就会小一些，扩散就不会那么严重。另外柱子里的微珠大小均匀一些也会有帮助。这种改进带来的一个问题就是，需要用FPLC之类的设备提供较高的压力, 柱子才跑得动。另外分辨率好的柱子往往不能手工装，得买预装的柱子，这样就很贵（很贵很贵！！！）。
唠叨了一大堆，我想表达的一个中心意思就是：如果你想从一个蛋白质混合物很干
净的把一个蛋白纯化出来，Gel filtration是肯定没戏的。虽然gel filtration 不能很精细的纯化蛋白，但是它还有另两个非常重要的用途。一个是脱盐，另一个是确定蛋白大小。这两个用途是其他种类的色谱没法作到的。
（十三）装柱子的学问。
上篇提到了Gel filtration的基本原理，现在谈谈我装柱子的过程。我们用的是Amersham 的 XK26/40的空柱子，然后往里面填充Sephacryl S-300 HR 的resin。按道理说，要提高分辨率，柱子应该是越长越细才好，这种柱子虽然不短，但是挺粗的。但是一个好处就是，样品体积可以大一些。
装柱子本身就是一件很tricky的事情，以至与这课的教程上专门列了一小节来解释怎么装柱子。我们这一组人中，我负责装柱子。一开始就是洗resin了，用粗制烧结玻板过滤的漏斗来洗，感觉这方法还挺快的。洗完了，就把resin重悬成50%的slurry，然后就是往柱子里头倒了。但是呢，有一个小窍门，就是必须先封闭柱子的下出口，往柱子里面倒10%体积的buffer。我过去装柱子犯傻，不知道要这么做，结果发现下面的resin 不均匀不说，还有一大堆气泡。所以先加buffer是很必要的。倒slurry的时候还得用玻棒引流，这样可以尽可能的避免气泡。然后就是等了，等resin 沉降３０分钟后，就可以打开柱子的下出液口，让多余的缓冲液流出去。液面低到靠近柱面的时候呢，就可以把上端液流接头接到柱子上方。这个过程最麻烦了，主要是不能引入气泡，所以先得让这个接头装置里面充满缓冲夜，把气泡赶出来。我第一次做没经验，费了九牛二虎之力才搞定了。然后就是接上蠕动泵(peristaltic pump) 加压，让resin继续紧缩一下。随着柱面的下降，接头装置还得不断往下移动，使得接头刚刚好与柱面接触。接触不紧密的话，等于是冲淡了样品，分辨率会降低。
柱子装好了，但还不能开始跑样品。为什么呢？因为这种柱子的质量必须很好才能起到分离蛋白的效果，否则是根本没法work的。所以呢，首先得测试这个柱子是否真的装好了。测试过程很简单，就是跑一下蓝色葡聚糖(blue dextran)，蓝色葡聚糖是带有蓝色染料的多糖高分子聚合体，体积非常大，所以在空体积(void volume)就会洗脱出来。跑蓝色葡聚糖可以起到三个目的。第一个就是确定void volume，知道这个空体积是很重要的。因为每次装柱子，实际resin的总体积都会有微小的不同。特定蛋白在柱子的洗脱体积与空体积的比值是一定的，所以只要知道了空体积，就能知道蛋白大概会在什么时候洗脱出来。第二个就是确定样品会被稀释多少。第三个呢，是柱子是否装的均匀。如果装的不均匀，葡聚糖j就会跑得形状怪异。一般来说呢，柱子下端堆积会比上端均匀，为了分辨度好，应该从更均匀的一端上样。所以我们在做的时候，是从下端上样的。
忙活了半天，当所有装置都装好的时候，感觉还是挺兴奋的。首先是蠕动泵，然后是柱子，然后是UV monitor加记录仪。整套装置不贵，功能却很齐全。
（十四）anfinsen的疑虑
跑完sephacryl柱子，组分就可以过DNA affinity column。DNA affinity column虽然很重要，但是这一步技术上来说要求很低。买来CNBR活化好的agarose，然后让特定序列的寡聚核苷酸固定上去就行了，柱子也是最简单便宜的一次性柱子。
亲合层析是目前最常用也最强大的一种蛋白质纯化技术, 纯化效率比别的层析方法可以高出一两个数量级。这种方法诞生是六十年代的事情。当时是在NIH的Anfinsen实验室。Anfinsen是一个诺贝尔奖获得者，可以说是蛋白质折叠研究的老祖宗。他主要贡献是通过研究ribonuclease 的变性和重折叠证明氨基酸序列就可以决定蛋白质最后的三维结构。他实验室那时侯有一个学生一个project是从葡萄球菌里面提取大量核酸酶，然后研究enzyme/inhibitor interaction。这个纯化可是很麻烦的事情，用gel filtration, ionexchange, hydrophobic interaction, 效率都很低。有人可能会问，怎么不在E.Coli表达his-tag重组蛋白，然后用 Ni- beads纯化啊？答案很简单，那个时候根本没有molecular cloning 这些技术，也没Nibeads这些东西，Nibeads也是亲合层析的一种，是好多年以后才发明的。这个学生有一天突发奇想，既然inhibitor可以与enzyme结合，为什么不能把inhibitor 固定在beads上面，然后用来纯化蛋白呢？后来他试了一把，结果非常成功。搞笑的是，anfinsen自己很怀疑这个技术是否能work, 勉强答应把自己名字署在在那个学生的文章，还强调如果没有别人能重复，自己心就是悬着的。呵呵。从此以后，各种各样的亲合层析层出不穷，成为生物实验室蛋白质纯化的最主要工具。
八卦完历史，现在介绍一下亲合层析的种类。通用的亲合层析包括IMAC(Immobilized Metal Affinity Chromatography)和IAC(Immunological Affinity Chromatography)。这些东东 大家应该都熟，类似于Ni beads , proteinA beads 之类的东西， 几乎所有人都会用到。需要动点脑筋的是一些利用特定蛋白质特定性质的亲合层析。比如我们实验室研究的糖基转移酶把，有两个反应底物，一个是nucleotide-sugar,另一个是一个小蛋白质 EGF repeats。 由于这个酶与两个底物都有结合， 所以可以把这两种底物分别结合在beads上，然后跑两次亲合层析。AP-1的纯化呢，则是利用了转录因子与DNA序列的特异结合。所以呢，在做亲合层析之前，一定要根据蛋白质本身的特点来选择相应的ligand。决定了ligand之后呢，就得考虑怎么把ligand偶连在beads上了。
CNBr活化是最常用的一个方法。原理很简单，CNBr的碳对beads上的羟基发起亲电进攻，产生一种叫cyclic imido carbonate的中间产物, 蛋白质或者核酸的伯胺基团(primary amine , -NH2) 与其发生反应， 形成共价键联在beads上。 蛋白质的primary amine主要来自于lysine, 如果要偶连的蛋白没有lysine用这种偶连方法就不好。DNA的primary amine来自于AGC三种碱基。DNA是双链互补的结构，碱基上的primary amine都要形成氢键。所以呢，要想把DNA oligo固定好，必须
得有不配对的overhang才行。这是一个小窍门，但是给我们的一个启示是，要做好affinity resin, 了解一些基本的偶连方法的化学原理是很有用的。
（十五）AP1的活性测定
第二个模块的实验，DNA affinity chromatography之后我们又跑了一个更精细的
Gel filtration，用的是Amersham卖的Superose 6预装柱子。纯化步骤就只有这么多了。剩下的就是一些活性测定。无论是sephacryl分出来的组分还是DNA affinity column分出来的组分，我们都测试了AP1的活性。方法呢就只有两种，一种是凝胶迁移率变动分析(EMSA)，另一种是DNA水解酶I 足迹分析 (DNase I footprinting assay)，都可以用来分析蛋白与特定DNA的结合能力。我过去没做过这两种实验，所以感觉很新奇，做的也格外卖 力，结果也还不错。
Gel Mobility-shift assay 原理很简单，把蛋白质样品和P32标记的寡聚核苷酸探针
一起孵育十几分钟, 然后拿去跑一个低浓度acrylamide胶。如果探针结合上蛋白了，速度会变慢很多，就会停滞在胶的上段；如果没有结合上，探针就会自由的跑到胶的下段去。然后把胶拿去做放射自显影就行了。跑胶的装置块头挺大的，是用来跑DNA测序胶的装置。把两大块玻璃板和两片spacer夹起来之后, instructor先做一个gel plug，就是配少量gel溶液，然后加过量的TEMED，然后迅速加到玻璃板中间，这些胶还没漏完就会凝固，所以会封住底端。这是一个小窍门，据instructor 讲，这个方法虽然很粗糙，但是比其他任何封底的办法都管用。还有一个小窍门。是这样的，由于胶的浓度低，比较脆弱，另外尺寸比较大。跑完如果把一块玻璃板从胶上拿开的话，胶的某些部分会分别粘在两个玻璃板上，这样取胶的时候就很容易把整个胶弄破。我们做胶的时候，指导老师要我们把一块玻璃板的贴着胶的一面硅化（用sigmacote, 成分是氯化有机硅氧烷) 一下，使得这一面比较疏水，就不会与胶粘在一起了。这样打开胶夹层的时候,胶只会紧紧贴在一面玻璃上面，把胶和这整块玻璃拿去放射自显影就行了。生物实验要想令人心服口服，没有对照是不行的。EMSA也不例外。阳性对照很简单，是看看系统能不能work。关键是阴性对照，来看蛋白质与探针的结合是否特异。EMSA的阴性对照有两种，一种呢，是用来看和探针的结合的蛋白是不是特异的某一种蛋白。做法很简单，就是蛋白质和探针孵育的同时加入抗那种蛋白的抗体，抗体识别蛋白质之后会形成更大的protein complex,在胶看起来就是探针的迁移率进一步降低了。这叫\"supershift\"。另一种对照呢，是看蛋白质与探针的结合是不是与探针序列有关，因为如果是非特异性的结合，纯化就没有意义了。这种对照也很简单，在蛋白质与探针孵育的同时，加入没有同位素标记的探针来竞争。如果加入完全同序列的竞争DNA可以削弱protein-DNA interaction， 一两个nucleotide不一样就无法削弱的话， 说明看到的探针与蛋白质的结合是跟探针序列紧密相关的。 我们在实验中用了
第二种control, 效果挺惊人，仅仅是两个nucleotide和探针不一样，竞争DNA探针就没 法work了。
Gel Mobility-shift assay虽然能够证明一段Oligos是否能和蛋白质结合，却还是不
能告诉我们该蛋白质到底与哪一小段的序列直接接触。DNAase I footprinting assay 正是用来解决这个问题的。DNase I 可以随机的分解DNA，正常情况下，一段DNA探针各处被酶切的可能性大致相当，如果跑胶再做放射自显影的话，看到的会是DNA ladder一样的东西。但是，如果有蛋白与特定区域相结合，DNase I无法酶切那一部分，我们看到的ladder 就会空缺一部分。这样我们可以知道那一部分没有被切到。这个实验步骤其实不复杂，但是有些tricky，实验的关键是DNase I 的用量和酶切时间。首先是做同位素标记探针的stock solution。stock solution里面除了探针以外，还加了非特异DNA,类似于poly(dI-dC) poly(dA-dT)之类的东西。有一种成分引起了我的注意，聚乙烯醇(poly-vinyl alcohol)。
这东东比较粘稠，为什么要加它呢？大家想想看，用来做DNAase I footprinting assay 的样品都是通过跑柱子的fractions，转录因子必定是被稀释得很厉害的。足迹实验最关键的就是要保证样品蛋白和探针有充分的结合。聚乙烯醇性质就象一个\"分子海绵\"，占溶液体积不说，还跟蛋白质抢夺水分子，所以加入这个东东之后呢，蛋白质和探针的有效浓度都增大了，这样有利于蛋白质和探针的相互结合。聚乙烯醇的作用原理跟PEG很相似，第三个模块的实验里面会用到PEG沉淀。探针stock solution配好之后，就是加我们纯化出来的组分，孵育十几分钟。之后呢就是做DNAse I 酶切。我们这一组里，我和丹麦女生负责做酶切，这个酶切可是把我们忙坏了。为什么呢？酶切一共有三步，间隔时间很短。第一步是加Ca2+和Mg2+孵育一分钟, 第二步是加DNase I 孵育一分钟, 第三步是加反应中止液。我们是三个三个一做, 每20秒加一个样品, 这样三分钟三个样品都完成了。丹麦女孩计时，然后我加样品。可能是太紧张了把，我们连犯了两次错误，漏加了Ca/Mg，只得重做几个样品。最后看结果的时候，我还特紧张，因为这是很重要的一份试验数据，最后结果很不
错，还受了老师表扬，呵呵。
好了，第二模块的实验，到这里就差不多了。这个培训课两星期的课程也进行了一
半。全体成员放假一天休息，而放假前一天晚上也没有报告。我学校离CSH很近，索性晚上就溜回去了，顺便还把YL硬拉出来听我汇报学习心得，呵呵。
（十六）浮起来的细胞膜
休息了一整天，晚上全体学员和老师去一家sushi店饱餐了一顿生鱼片。第二天
早上，第三个模块的实验开始了。老师是Sue-Hwa Lin， 这一个模块是从大鼠肝脏里面提取胰岛素受体并且做一些鉴定。四个模块的实验之中，我最喜欢这个模块。主要是因为这是唯一一个设计膜蛋白纯化的实验，而膜蛋白纯化是所有蛋白质纯化中最麻烦的一类。受体蛋白纯化尤其麻烦，往往可能找不到又快又准确的测活办法。胰岛素受体即使溶解在去垢剂里面也能与胰岛素接合，所以用简单的binding assay就可以测活了。相比之下有些受体就不那么好伺侯了，比如我研究的Notch受体，配体也是膜蛋白，Notch和配体必须都簇集在细胞表面或者固体表面才能有接合，溶液中的游离状态下根本没法相互作用。
Sue-Hwa Lin是一个好老师，喜欢在做实验之前详细给我们讲解背景知识，这一
点上她比其他三位老师都做得好。另外她的助手是一位台湾的中年妇女，在Sue-Hwa 实验室做research assistant professor。这位助手特别nice，给我帮助很大。
好了，现在聊一聊纯化的实验步骤。首先是把大鼠肝脏的质膜部分分离出来，然
后呢用去垢剂溶解一下，用凝集素层析来粗分一下组分，然后做受体测活与鉴定。大家可能注意到，最后纯化出来的受体只是粗产品。事实上，手册上这个实验里面还得做一步insulin affinity chromatography来精制一下的。但是最近好多年，很多学员更希望做一些重组蛋白纯化的实验，所以就把原来的实验给切短了。我觉得这种做法很不明智，因为重组蛋白纯化的实验实在不需要花几千刀来冷泉港学的。
细胞膜结构的分离是一门大学问，著名的Methods in Enzymology有专门的一辑
整本都是讲这个的。细胞膜结构主要有核膜，质膜，线粒体，内质网，高尔基体，溶酶体等等。其中核膜是最容易的，因为细胞核很重，稍微离心一下，就沉淀下来了。其它的膜结构中呢，线粒体是最重的，质膜由于有胆固醇成分，所以是最轻的。这两种膜结构也是很好分开的。剩下的膜结构比重比较相似，所以不好分。
膜结构分离的方法呢，有很多种，但是变来变去，无非都是两种基本方法的组合：
差速离心+蔗糖梯度离心。差速离心（differential centrifugation）是粗分膜结构的
一种常用方法。其实很简单，就是用不同的速度离心三次。首先用等渗缓冲夜来做组织的匀浆，然后就开始离心。第一次是低速离心，只用600g，这么小的离心力下，只有未破的细胞和细胞核才会沉淀下来。细胞主要的膜结构以及细胞质都还在上清里面。拿上清再做第二次离心，这回离心力大了一个数量级，到了8000g。由于线粒体比其它膜结构要重一些，所以线粒体沉淀下来，而其它膜结构还在上清里面。去上清进行第三次离心，这回离心力比前一次又要大一个数量级到了十万g。所有的膜结构都会在此时沉淀下来，所以也包括质膜。需要强调的是，差速离心的分离是非常粗糙的，并不是十分干净。下一步的蔗糖梯度离心就要精细得多。但不管是什么分离方法，本质上都不完美，千万不要指望从某篇文章找到一个方法就能套用。最好的办法是利用细胞膜结构特征性的一些标记物（比如plasma membrane, 测5\' nucleotidase 的活性)来分析分离方法的好坏，并加以改进。
我们分离质膜用的方法稍微特殊一点，省掉了差速离心这一步。这种方法对于分离
大鼠肝脏质膜比较管用，对别的组织就不一定好用了。我们一组四个人，每人都分了一个新鲜冰冻的大鼠肝脏（解冻后很难闻），然后就是拿刀片剁啊剁。弄碎了之后就加一种低渗缓冲液，再把碎的肝脏和缓冲液倒到Dounce匀浆器里面做匀浆。匀浆用的缓冲液里面加有Ca2+，比较重要。钙离子能够促进质膜碎片的聚集，这样在1500g这样小的离心力下，质膜也能被沉淀下来。我们把匀浆用两层cheese cloth过滤，去掉了很多结缔组织。然后就是用1500g离心了。拿出离心管一看，果然有一个很松的pellet，包括了质膜，细胞核之类的东西。然后再把pellet转移到Dounce匀浆器再弄均匀了。下面就开始准备蔗糖梯度离心(sucrose gradient)。蔗糖梯度离心是十分古老的一种方法，但直到现在还有很广泛的应用。我们首先往pellet 匀浆里面加69%的蔗糖溶液，一直到终浓度变为44%为止。蔗糖的浓度十分的重要，如果不准的话，根本就没法分开。我们有一个折射仪，可以很快的测出溶液的折射率以及对应的蔗糖浓度。这个折射仪看起来很粗糙，但是却十分好用。下一步呢，就是把加了蔗糖的匀浆转移到超速离心管里，然后在上层铺一层42.3%的蔗糖溶液，接着就是超速离心两小时（九万g）。前面提到过，质膜相比其他膜结构而言是比较轻的，所以呢，在离心的过程中就会浮到上层来。我们吃罢午饭，就回来看离心管，果然看到一层棕色的东西浮在最上面。这层质膜看起来有点像果冻，可以用小勺舀出来。到这里质膜的分离就算完成了。