散人笔记

（十七）何去何从

上一章提到从大鼠肝脏提取质膜的方法。质膜准备好了，下一步就得考虑怎么溶解质膜。最主要的问题是：用什么去垢剂呢？Dr.Lin在这一步试验里面要求每一组中的四个人各选一种去垢剂来溶解质膜，纯化完之后再比较不同去垢剂的蛋白质纯化效率，看看哪一种去垢剂最有效。选择去垢剂很简单，无非是想让膜蛋白能被充分的溶解解离下来，同时又不使蛋白变性。事实上，纯化膜蛋白时去垢剂的选择是没有规律可循，除了一些显而易见的不适和做纯化的去垢剂(比如SDS)外，很难讲什么去垢剂好什么去垢剂不好。所以，只能具体问题具体分析，一个一个去尝试。我们这一组人选的四种去垢剂分别是: Triton X100, Sodium Cholate, Chaps, 和Octyl glucoside。我选的是Octyl Glucoside。

好了，我先来讲讲去垢剂的小常识。去垢剂其实是很大一门学问，我几年前就花过好多力气来学习其中的一些知识，但到现在为止还是只懂了一些皮毛。这里就权当抛砖引玉了。首先，什么是去垢剂(detergent)呢？就是同时具有疏水和亲水两种基团的化合物。虽然脂类化合物也有类似性质，但是去垢剂能够形成胶束(micelle)，所以相比之下非常易于在水中溶解。去垢剂的疏水基团一般是下面三种(1)直链或者支链烷基结构(2)类固醇之类的多元环结构(3)取代苯基结构(比如大家常用的Triton X100或者NP40)。去垢剂的亲水基团一般有(1)羧酸基团，比如胆酸钠(sodium cholate) (2)两性离子基团, 比如CHAPS (3)糖类衍生物,比如Octyl glucoside, (4)聚乙氧乙醇基团, 比如Triton X-100和NP-40。 Triton X100和NP40大家都用得比较多。 它们实际上是同一种去垢剂，疏水基团是取代苯基，而亲水基团是聚乙氧乙醇基团。我想强调的一点是，聚乙氧乙醇基团与氧气很容易发生反应形成过氧化物, 如果用在蛋白质纯化里面，很有可能会破坏蛋白质的活性。所以一般商业化的,比较纯的NP-40和Triton X-100都是小包装，而且在包装瓶子里面充有惰性气体。

选择适当去垢剂来纯化膜蛋白，有一些实际问题必须先想好。我强烈建议大家以后选择和使用去垢剂的时候先考虑以下几个问题：

(1)选择的去垢剂是否干扰蛋白质浓度的测定？
类似于Triton X100之类的去垢剂有苯环结构，所以在280nm有很强的吸收。而相比之下CHAPS和胆酸钠之类的去垢剂就没有这个问题。另外，有些去垢剂会严重的干扰一些protein assay。比如常用的Bradford assay，用的是commassie blue G-250染料。这种染料在酸性条件下呈现为褐色胶体物质，但在与疏水物质结合之后会变得稳定而呈现蓝色。所以可以想见，这种染料不单能染蛋白质，也能染一些去垢剂。我们在实验一开始专门做了测试，发现Triton X100和sodium cholate对Bradford assay 干扰比较严重，chaps, 尤其是Octyl glucoside基本上没有什么干扰。遇到这种干扰问题，要么换去垢剂，要么换protein assay方法。

(2)是否需要在以后的步骤里面去掉或者置换掉去垢剂？
去掉或者置换掉去垢剂是一件很麻烦的事情。因为很多去垢剂会形成胶束结构，分子量非常大，所以没法用简单的透析或者超滤来去掉。比如大家常用的Triton X100和NP40, 单体分子量是628,胶束的单体聚集数是140, 所以胶束的分子量有87KD了,这显然是没有办法用透析来去掉的。相比之下CHAPS单体分子量615,聚集数是10, 胶束分子量只有6KD,用透析就很容易去掉了。

(3)是否需要在以后的步骤里面用到离子交换层析或者疏水作用层析？
离子型去垢剂会与相应离子交换柱结合得很好，干扰蛋白质的纯化。所以如果要用到离子交换柱，要用非离子型或者两性离子型的去垢剂。另外，由于去垢剂有疏水基团，一般用了去垢剂之后，就不应该在后续步骤里采用疏水作用层析的方法了。　　　

(4)如果在后续步骤中选用凝集素层析, 选用的去垢剂是否构成干扰？
凝集素是一种植物中提取的一系列可以与糖基结合的蛋白。因为很多膜蛋白都有糖基修饰，凝集素层析可以利用这种性质来纯化一些膜蛋白。类似与Octyl Glucoside的去垢剂，亲水基团是糖或者糖的衍生物，有可能与凝集素结合，降低凝集素的纯化效果。比如ConA agarose常常被用来纯化具有High-mannose type　N-glycan的蛋白质，与mannose和glucose都能结合。如果此时用Octyl glucoside，就无法纯化蛋白了，因为Octyl glucoside的亲水基团是一个glucose。

(5)是否需要用弱的去垢剂来去掉soluble protein?
有时候用去垢剂并非完全是用来溶解膜蛋百，其实也可以用来去掉一些可溶蛋白杂质。比如Sodium cholate是一种很弱的去垢剂，虽然不能用来很有效的溶解insulin receptor之类的膜蛋白, 但是可是用来处理plasma membrane prep, 去掉大量的可溶蛋白杂质。

(6)是否需要用去垢剂来做Two phase partitioning？
Triton X114是一种很特别的去垢剂，在室温下很容易溶解在水中，但是在３０摄氏度以上会从水相中脱离出来，并且连带的把膜蛋白也一起拽出来。这样呢，就可以把膜蛋白和可溶蛋白分开。这种方法叫做，two phase partitioning。我并不太喜欢这种方法，因为有一组人做了这个实验，感觉分得并不是那么干净，在可溶相还是有不少insulin receptor。

(7)去垢剂的用量是否足够?
要充分的溶解膜蛋白，去垢剂的用量必须足够才行。我们在试验中，先测了一下起始样品的蛋白总浓度，然后以detergent : protein 5:1的比例加去垢剂。

(8)选用的去垢剂是否影响所纯化蛋白的活性？
有些情况下，某些十分娇贵的蛋白质对一些去垢剂很敏感。问题是,很难预先就知道那种去垢剂会降低蛋白活性。但是，我觉得大家至少得意识到，去垢剂很有可能干扰蛋白活性的。我举一个例子。我是做糖基转移酶的。有一种酶叫Protein O-mannosyltransferase 1 是一种膜蛋白，跟muscular dystrophy有关系，是一个研究热点。很多实验室都怀疑这种蛋白是糖基转移酶，但是很长一段时间里面，很多实验室发现表达的重组蛋白都没有活性。一直到前两年，终于有一个实验室证明了这个蛋白是有活性的。之所以很多实验室之前都不成功，其中一个重要因素就是去垢剂。Triton X100和NP40是很常用的去垢剂。这个成功的实验室发现，如果用常规浓度下的Triton X-100，表达的Protein O-mannosyltransferase完全没有活性，相比之下用了Octyl thio-glucoside就有活性了！所以呢，如果大家试图表达一个膜蛋白，却没有活性，不妨换一下去垢剂，说不定会有意外的惊喜。



（十八）凝集素层析

我们用去垢剂溶解了膜蛋白之后，紧跟着的一步就是用Wheat Germ Aglutinin(WGA) agarose来部分纯化insulin receptor。WGA是凝集素(Lectin）中的一种，而Lectin指的是可以与糖基结合的蛋白质。现在常用来做蛋白质纯化的凝集素绝大部分是从植物中提取出来的。绝大部分膜蛋白的extracellular domain和分泌蛋白都有N-linked glycan 的糖基修饰。根据这个性质，用固定有适当的凝集素的beads，比如WGA agarose或者ConA agarose可以部分提纯膜蛋白。注意，只能是部分提纯，凝集素层析并不能一步登天，让蛋白质比活力一下子提高上千倍，至多几十倍就已经很不错了。但尽管如此，凝集素层析是一种很好的办法，因为buffer条件非常温和，洗脱液是加了糖的buffer，透析什么的也方便，非常非常适合于和其他层析方法偶连起来用。

纯化膜蛋白用的最主要的两种凝集素是WGA和ConA。谈到这里，我先向大家介绍一下N-linked glycans。N-linked glycans 是哺乳动物细胞中最常见的一种糖基修饰。 这种糖基是加在膜蛋白的extracellular domain 上面。如果膜蛋白有这个sequence, N-X-S/T , 最前面的Asparagine多半被N-glycan修饰。N-glycan是一个Oligosaccharide 结构，好像一个分叉的树枝一样。膜蛋白的新生肽链在被翻译合成的同时会被直接塞入ER lumen，同时就会被加上一整个树枝状的N-glycan core。这个N-glycan加上去之后，并不是就大功告成了，而是要经历一系列“裁减”，有的糖基会被去掉，新的糖基又会被加上，这样最后的N-glycan structure往往是千奇百怪。 但是N-glycan的“主干”都是相似的.


Man 　　　Man
\\ /
\\Man/
|
GlcNAc
|
GlcNAc
|
N-X-S/T

Man代表Mannose甘露糖，而GlcNAc代表N-乙酰葡萄糖胺.



保留在ER或者Cis-Golgi的膜蛋白,N-glycan往往是High-mannose type。在这种N-glycan的末端有很多甘露糖(mannose)修饰。最适合于纯化这种蛋白的凝集素是ConA。ConA主要识别alpha-mannose, alpha-glucose和alpha-GlcNAc,所以可以这三种糖溶液来做洗脱液。分泌出去的蛋白，或者已经到细胞表面的膜蛋白的N-glycan往往是complex type。这种complex type N-glycan的末端往往修饰有Sialic acid（唾液酸，一种带负电的糖）和GlcNAc。而WGA主要识别GlcNAc和Sialic acids，所以特别适合于纯化这种类型的蛋白，洗脱液可以用GlcNAc和Sialic acid溶液。

最后需要指出来是，纯化一种特定蛋白，选择用什么凝集素是完全经验性的，需要提前测试才知道的。　


（十九）MDA-BF-1的启示

凝集素层析实际操作起来很简单，跟过简单的Ni柱子一样。拿到洗脱的蛋白之后，我们就着手开始测活，分析纯化的效率和倍数。胰岛素受体不是酶，所以测活是利用胰岛素与受体的特异结合。具体的测活步骤非常简单，就是把I-125标记的胰岛素和纯化的组分混合然后孵育一段时间。然后加PEG（Poly ethylene Glycol ) 6000沉淀胰岛素受体，而游离的胰岛素不会被沉淀下来。说到PEG沉淀，Dr.Lin讲了她自己闹的一个笑话。是这样的，她实验室发现了一个蛋白质因子 MDA-BF-1。这个因子对Osteoblast（成骨细胞）的增长有促进作用。 然后呢，她就想把这个因子的受体给找出来。首先一步呢，就是得有一个测活方法。所以她就比照insulin receptor的测活方法而设计了一个方法, 其中连PEG沉淀都是一样的。结果呢，这个测活试验完全失败了。问题出在PEG沉淀这一步。PEG作为一种多元醇，可以想像为一种“分子海绵”，可以吸附水分子。这样样品中蛋白的有效浓度实际变大了好多，容易出现聚集然后沉淀的现象。这就是为什么insuline receptor可以被沉淀下来的原因。而游离的胰岛素本身分子量很小，只有不到10KD，而且非常易溶，所以即使加了PEG，也沉淀不下来。而Dr. Lin发现的MDA-BF-1因子，分子量相对insulin大了好多，有50多KD，所以游离的因子也能被PEG沉淀下来。听完这个小插曲，我感觉挺吃惊，作为一个有经验的教授，Dr.Lin在没弄清楚原理的情况下竟然就胡乱套用protocol 。所以呢，我感觉做实验，仅仅是follow
protocol把实验完成了，是远远不够的。一定得搞清楚原理是怎么回事，这样出了问题才知道怎么去改进。

MDA-BF-1不仅仅给我以上的启示。Dr.Lin给我们做了一个seminar， 讲述她的研究进展。 其中她重点谈到了MDA-BF-1这个因子。 她实验室现在正在做的是试图用蛋白质纯化的办法来找出MDA-BF-1的受体。她的测活方法是这样的，首先表达MDA-BF1的重组蛋白，然后用同位素标记，然后做binding assay。这个binding assay 很麻烦，因为没办法用简单的手段把游离的MDA-BF-1和与受体结合上的MDA-BF-1分开，只能用gel filtration column来分开，每做一次assay都很麻烦。虽然Dr.Lin提到她们还没有找到那个受体，我个人觉得这个方法不是很明智。为什么呢?纯化
蛋白的过程中，各种膜蛋白都处于一种被去垢剂溶解的匀浆状态，这种情况下，一些正常生理条件下不会与MDA-BF1结合的受体可能也会与其结合。 这样一来，纯化出来的东西就是乱七八糟的了。另外一种可能性是: 有很多膜蛋白能与MDA-BF-1相互作用， 但是只有一种膜蛋白能够启动下游的信号传导， 促进Osteoblast的增长。这种binding assay的测活方法虽然可以找出与MDA-BF-1结合得最好的膜蛋白，但是找出的膜蛋白可能根本没有信号传导的功能。需要强调的是，蛋白质纯化绝对不是万能的。要想纯化出一个未知蛋白，最最重要的是要有一个简单明了直接的测活方法。Dr.Lin 实验的问题，说到底，就是没有好的测活方法。

这一个模块的纯化试验到此就为止了。我们测活之后，比较了各种去垢剂的纯化效率，发现Triton , CHAPS, Octyl Glucoside都还比较好，Sodium Cholate则差好多。

原始的实验手册上还有进一步的insulin affinity chromatography和其他分析。而教员为了满足很多学生做做重组蛋白表达纯化的愿望，用一些比较白痴的的实验取代了原有很经典的实验。比如一个实验是从SF9里面纯化一个his tag的蛋白&%$&$#$#!!! 我知道要做这个试验之后，几乎要抓狂了。我这一组其他几个人还把这个试验当宝，抢着做。而我最后选择去跑了一个2D gel。就这样，第三个模块的实验结束了。


（二十）钙调蛋白

纯化胰岛素受体的模块结束之后，我们这一组人进入到最后一个模块，做钙调蛋白的纯化和分析。钙调蛋白(Calmodulin)十分重要，几乎在所有真核细胞里面都能找到。这个蛋白只有148个氨基酸，大概16KD，比较小。有Ca2+结合的情况下，钙调蛋白的构象可以发生较大的改变，从而激活一系列酶的活性，比如cyclic nucleotide phosphodiesterase, 一些protein kinases, phosphatases 和ATPase等等。这一个模块的实验中，我们是从鸡胗里面提取和纯化钙调蛋白，然后再做一些分析。

这一个模块的纯化设计，可以说是最大限度的利用了钙调蛋白的特殊性质，我觉得设计的很精彩。不过我对这个模块的实验经历并不是很满意。教员的实验助手只有一个人，而且非常不称职，对实验本身似乎不太了解，也不是很helpful，感觉比前几个模块的实验助手差多了。教员叫Constantin，是一个俄罗斯人，在rutgers当教授。我起初对他印象不佳，后来发现这个人其实很nice,非常和蔼。
　　
整个纯化步骤大概是这样的。首先把鸡胗剁碎匀浆，然后做粗分离，用硫酸铵沉淀的办法把杂蛋白都沉淀下来。然后再做等电点沉淀，把Calmodulin沉淀下来。重溶沉淀之后再做透析来脱盐。然后再过阴离子交换柱DEAE Sephadex A-50。纯化出来的组分再过疏水作用层析柱，就可以得到很纯的Calmodulin了，用Commassie blue都可以染出来。

我们做的实验中没有对Calmodulin的测活实验，可能是因为最后纯化出来的Calmodulin很多,可以做光谱分析之类的实验进行分析，所以就省掉了。但我多少有一点本末倒置的感觉。因为对未知蛋白质纯化，首先就得有一个靠的住的测活方法, 然后才能逐渐制定最优化的纯化策略。另外，在设计测活方法之前，还必须搞清楚，有生物活性的物质是不是蛋白质。一般有下列几种方法。(1)对protease的是否敏感。(2)生物活性不会因为透析而丢掉(3)Urea之类的变性剂是否降低生物活性(4)对化学修饰剂(比如sulfur hydryl blocker idoacetamide)是否敏感。

我们提取钙调蛋白所用的组织原料，鸡胗，量挺大的，有一斤之多，红红的一大堆肉。这样的组织，匀浆是一件很麻烦的事情，所以我们用了一个大号的匀浆机，试图把肉都捣烂。但是效果不好，重复了两次，还是有很多肉没有被弄碎，所以只好扔掉了。值得强调的是，对于这样大量组织的匀浆，缓冲液的配方必须有所考虑。首先，离子强度要低一点，高离子强度容易导致蛋白质聚集和沉淀；其次，最好加如EDTA之类金属离子螯合剂。这是因为组织里面会有很多二价阳离子，有可能会与组织里面的一些无机盐（比如磷酸盐）反应产生沉淀，导致匀浆中蛋白质不能完全溶解。最后，如果要在后续步骤中过阳离子交换柱，要避免有primary amine的缓冲物（比如tris），如果要过阴离子交换柱，则要避免用磷酸buffer。

我们拿到匀浆之后，然后过滤。接着的一步就是硫酸铵沉淀。硫酸铵沉淀的原理我前面提到过，所以就不多说了。我们用了饱和硫酸铵浓度（６０％）来沉淀。 钙调蛋白这个东东很奇怪，没有钙离子结合的情况下很亲水，所以即使用饱和硫酸铵，也沉淀不下来。但大量的杂蛋白都能被沉淀下来。当然也不是所有的杂蛋白，至少血红蛋白就不行，因为硫酸铵沉淀后的上清还是红色的。下一步呢，就是等电点沉淀。钙调蛋白是一个很酸的蛋白，等电点只有4.05，所以可以加硫酸使pH降到4.05附近，蛋白总电荷为零，就容易聚集沉淀。我的感觉是，等电点沉淀并不是很可靠的方法，因为很难保证沉淀过程中蛋白会不会变性。搞不好，蛋白沉淀后就没法重溶了。钙调蛋白溶解性比较好，也比较皮实，重溶起来比较容易。重溶用的是Tris的溶液，由于这个时候样品溶液里面盐浓度很高，不能直接上样到下一步的离子交换柱上，所以需要透析。我们先把样品放到蒸馏水中透析两三个小时，然后再换到一般的缓冲液里。透析大家估计都熟悉，也没有什么技术含量。只有两点值得注意，首先，透析袋不能装满，因为透析过程中样品体积会增加。其次，透析袋空的地方要弄瘪，不能留空气，否则样品体积增大后，扎紧的透析袋可能会受压而破裂。


（二十一）离子交换层析


做完硫酸铵沉淀以及等电点沉淀之后，下一步就是做离子交换层析(ion-exchange chromatography)。离子交换层析原理很简单，利用蛋白质表面的带电基团和resin上带相反电荷的ion exchanger group相互结合来纯化蛋白。离子交换柱和affinity chromatography一样，属于absorption/desorption型的层析方法，与gel filtration完全不一样，其中一个最大的优点是，样品体积可以很大，最后的洗脱样品的体积可以小很多，这样实际起到了一个浓缩样品的作用。还有一个优点是，离子交换层析其实不需要柱子，可以用batch 的方法（在离心管里面混合beads和样品）。当然如果beads量多情况下，batch方法平衡得不是很好，导致resolution不是很好。这一点我们做实验的时候深有体会，以后的一篇中我会提到。我们纯化钙调蛋白用了柱子做纯化，原因是因为所用的beads 相当于Sephadex G50再加上阴离子交换基团，所以实际上可以看成是ion-exchange 和gel filtration 的混合体。 Calmodulin分子量比较小， 所以很容易和分子量大的杂蛋白分开。

离子交换柱分为阳离子交换柱和阴离子交换柱，前者主要用来纯化偏碱性的蛋白质，后者则用来纯化偏酸性的蛋白质。绝大部分蛋白都偏酸性，所以阴离子交换柱用得更加普遍一些。常用的阳离子交换剂主要有Carboxymethyl 和sulfopropyl两种。Carboxymethyl比sulfopropyl要弱一些，所以同样的蛋白与这两种基团结合，后者的洗脱盐浓度得高一些。常用的阴离子交换剂有DEAE(diethyl aminoehtyl)和Quaternary amine两种。后者比前者强，适用的pH也更宽。选用何种离子交换剂要根据实际要纯化蛋白的性质来决定。比如我们纯化钙调蛋白就用的是弱的阴离子交换柱DEAE，因为前面我提过，钙调蛋白的pI很低，蛋白很酸，与弱的阴离子交换剂也能结合得很好。而很多其它的杂蛋白没有这么酸，所以结合不上。这样，用DEAE实际上可以有效的除去很多杂质。

离子交换柱真正跑起来时非常简单，没有什么技术含量，但是第一次纯化一种蛋白的时候，一定得先摸清起始条件。

首先要确定用什么缓冲液。缓冲物由于自己带电，所以也可以与ion-exchanger 结合。这种结合会带来两方面的干扰，一个是降低了缓冲物的浓度，因而降低了缓冲能力，另一个是与蛋白质竞争ion-exchanger。所以呢，如果用阴离子交换柱， 要避免用磷酸buffer之类的带负电的缓冲物，如果用阳离子交换柱，则要避免用Tris buffer之类的带正电的缓冲物。有的缓冲物是两性离子(zwitterionic)，比如HEPES，所以阴阳两种离子交换层析都适用。如果待纯化的蛋白是膜蛋白，要用去垢剂，则应该选用非离子型或者两性离子型的去垢剂，道理跟上面是一样的。

第二个要注意的起始条件是pH。有些时候要分离的蛋白的活性对pH非常敏感，所以pH没有太多选择。但很多情况，应该根据待纯化蛋白的性质而进行选择。以阴离子交换柱为例，如果蛋白结合得不好，可以提高一下pH,如果蛋白结合得太紧，需要高盐洗脱的话，则应该降低一下pH。要确定最适合的pH，可以做一个简单的小实验（以阴离子交换柱为例）。配pH从5.0到9.0，间隔为0.5的一系列缓冲液。用这些buffer先把beads平衡好了，然后向每一种pH平衡好的beads里面加一小等分的样品。孵育之后，取上清测活。如果蛋白质结合上去了，上清的活性就没有了。然后，取比活性刚刚开始结合的pH高0.5单位的pH作为离子交换层析实验的pH。注意，这里pH不是越高越好，pH太高，杂蛋白也能结合上，会降低ion-exchanger
的capacity。

确定了buffer和pH, 下一步要确定的是上样时的起始离子强度，也就是样品起始盐浓度。用来确定盐浓度的小实验是这么做的，配一系列盐浓度从0.1M到1M（间隔0.1M)的缓冲液。用这些buffer平衡 beads，　 然后加入一小等分的样品，
孵育之后，取上清测活。低盐浓度下的上清应该没有活性，因为蛋白可以与beads结合 ，较高盐浓度下, 上清中应开始出现活性。 然后选择刚刚低于洗脱蛋白所需盐浓度的浓度作为样品的起始盐浓度。这样做
的好处是, 一些与ionexchanger结合较弱的杂蛋白，一开始就不会结合到beads上去。另外，实际跑样品之前，如果样品体积比较大（比如数百毫升），必须测一下电导率以确定起始盐浓度符合要求。如果低了，就应该加盐，高了，就应该加水。　　　　


　（二十二）失败中的启示

离子交换层析之后是最后一步纯化，疏水作用层析(hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)。HIC和硫酸铵沉淀是同一个原理。蛋白质表面有一些疏水区域，如果在蛋白质样品溶液里面加足够的盐，就会与这些疏水区域争夺水分子。没有了足够的分子，这些疏水区域倾向于与其他疏水区域结合。HIC的beads上衍生有非极性基团，可以与蛋白质的疏水区域结合，这样蛋白质就能bind到柱子上。要想把蛋白质洗脱下来，则要用低盐缓冲液冲洗，盐浓度下降之后蛋白质与柱子的疏水相互作用也被削弱，所以能被冲洗下来。由于HIC要求样品的起始盐浓度很高，所以特别适于作为硫酸铵沉淀或者离子交换层析后续步骤。因为硫酸铵沉淀（无论是上清还是沉淀）和离子交换层析的产物，盐浓度都非常高，如果直接再跑HIC，不但省了透析脱盐的一步，还进一步纯化了蛋白。现在常用的HIC resin上的疏水基团有两种，一种是Phenyl 另一种是Octyl。比较而言，Octyl group更加疏水一些。我们这一次的实验中用的是Phenyl sepharose。值得强调的是，对于HIC而言，resin的衍生基团并不是越疏水就越好的。因为如果太疏水的话，与蛋白质的结合会十分紧密，以至于要加入有机溶剂，才能冲洗下来。但是有机溶剂同时又有可能使蛋白变性。

疏水作用层析特别适用于纯化钙调蛋白。因为钙调蛋白在有钙离子结合的条件下，高度疏水，即使在低盐浓度下也可以很牢固的与HIC column 结合。洗脱钙调蛋白时，用含有EDTA或者EGTA的缓冲液。失去钙离子的钙调蛋白疏水性会降低很多, 这样很容易被冲洗下来。

HIC这一步，我感觉要比前一步离子交换有用的多。为什么呢，这要从我们一组实验中的失败说起。跑DEAE柱子需要我们自己装柱，大小跟过去跑S-300柱子差不多，装好柱子之后我们就开始上样。起初这个柱子没什么问题，但在样品快要上完的时候，不知为何柱子里面大量的beads漏到了柱子的玻璃保温夹层里面。我们一看大事不好，只好把柱子停了，然后把beads全掏了出来，准备用batch的方法来洗脱蛋白。我们用了一个tissue culture过滤media的过滤器来做这件事情。beads 放在过滤漏斗里面，加含盐的缓冲液搅拌洗涤，然后抽真空让液体过滤出来。按道理，绝大部分钙调蛋白应该被0.9M NaCl的buffer冲洗下来。但是我们又发生了意外，冲洗的过程中过滤器被碰倒了，beads和洗脱液撒了一桌子！眼
看要成功了，竟然发生这种倒霉事情，全组人都很depressed，都有一种要就
义的感觉。教员Constantin比较有经验，他要我们把0.9M NaCl之前的低盐洗脱液混在一起直接做下一步疏水作用层析。这样一来，我们等于绕过了离子交换这一步。最后纯化纯化出来的蛋白让我们大吃一惊，不但非常纯不说，总量大概有几十个毫克，跟手册上给的通常产量差不多。这个结果说明一个问题，就是离子交换这一步虽然看起来很fancy，但对于钙调蛋白的纯化并不是那么重要。蛋白质纯化的步骤并不是越复杂越好，简单，快速，便宜的步骤才是最好的。

（二十三）正相与反相

我们纯化出钙调蛋白之后，就开始进行一些蛋白质化学的分析。主要是蛋白酶消化，反相HPLC分析，MALDI-TOF质谱之类的分析。我觉得在这个课程里面加一个质谱分析并不是那么有用，因为基本上只是演示实验，只是讲了讲皮毛而已。相比之下反相HPLC在蛋白质纯化中要重要得多。

HPLC的全称是High Performance Liquid Chromatography （高效液相色谱），这个名称听起来好像很尖端的样子，其实HPLC组成部件非常简单，主要是三部分，泵，柱子，和UV monitor。反相HPLC跟一般的色谱的一个显著不同是压力。为了保证纯化蛋白的分辨能力，反相HPLC柱的matrix材料颗粒非常精细，所以必须施加很大的压力才能跑得动柱子。相比之下，反相HPLC所需压力比一般gel filration柱子压力大十倍都不止。反相HPLC的分辨度十分惊人，远远超过其他色谱方法。分辨度高到什么地步呢，我举一个自己的例子。我原来在E.Coli里面表达EGF repeat，大概有7到8KD的样子，然后用体外反应加上一个fucose糖基。这个fucose分子量只有146。就这么小的区别，即使跑在SDS-PAGE上也是看不出来的，但是用反相HPLC可以很完全的把没有糖基和修饰上糖基的EGF repeats分成两个峰。可见反相HPLC有多么强大了。

反相HPLC虽然很强大，但是它最大的弱点是不能用来分离大的蛋白，只能用来分离小肽或者小蛋白（比如histone）。具体说起来，大于30KD的蛋白就可能不行了。原因是洗脱相里面用得是有机溶剂，容易使大蛋白，尤其是带有很多二级结构的蛋白变性。

反相HPLC为什么叫反相(reverse phase)呢? 这其实跟正相(normal phase) HPLC有关系。正相HPLC依靠提高流动相的极性来洗脱。而反相HPLC则相反，依靠降低流动相的极性来洗脱。正相和反相HPLC柱子的材料都是由silica gel（硅胶）构成的。反相HPLC柱子的silica gel上面还有衍生的alkyl group，所以疏水性强了许多。正相HPLC一般用来分离脂类分子。脂类分子有少许极性，如果样品溶解在有机溶剂里面，再过柱的话，可以与柱子的silica gel结合上。如果在流动相里面逐渐提高极性成分，脂分子就会被洗脱下来。反相HPLC则是用来分离蛋白质的。蛋白质有部分疏水性质，过反相柱的时候，可以与silica gel上的alkyl group相互结合。但是如果在流动相里面逐渐提高非极性成分（比如acetonitrile），蛋白质就会被洗脱下来。

大家可能注意到，反相HPLC的原理和疏水作用层析的原理很相似。但是，反相HPLC里面的蛋白质与柱子的疏水作用比一般疏水作用层析要强得多。原因就在于反相HPLC流动相中含有TFA（三氟乙酸）。TFA是一种强酸，所以能很有力质子化蛋白质中的羧基，是之不带负电。同时又能与蛋白质中正电基团形成离子对，进一步增加蛋白质与柱材料的疏水相互作用。

反相HPLC具体跑起来很简单，主要是操作仪器，先把蛋白质样品和0.1%TFA的溶液混合一下，然后上样，用0.1%TFA冲洗若干分钟，使得蛋白样品和柱子结合上。然后逐渐增加流动相中的acetonitrle（乙晴）浓度，洗脱蛋白。


　　　
（二十四）尾声

蛋白质纯化第十三天，也就是最后一天的时候，大家基本上都松弛了下来，开始准备狂欢。先是每人发了一件纪念T shirt，然后在CSHL的酒吧里面开酒会，再接着就是龙虾宴。不过气氛最热烈的还是龙虾宴之后的诗会。诗会我还是第一次碰到，要求每人写一首跟蛋白质纯化有关的诗，并且当众朗读，场面十分热闹和搞笑。我好不容易写了一首，是这样的：

　　　My protein

My protein used to be wild,
Like a naughty child,
He likes to play seek and hide,
which makes me feel really tired,
But now I can find him no matter it is day or night,
Because from ***, Al, Sue-hwa and Constantin,
I have learned how to Purify!

诗会之后，绝大部分同学和老师都在活动室打乒乓球或者台球。而我由于住得近，就直接开车回学校了。回想起来，这一次的课程十分令人难忘，认识了很多新朋友，学到了很多新知识，大大开阔了眼界。当然，指望在短短的两个星期就学会所有蛋白质纯化的技术是很不现实的，但是这个课程至少让我们认识到，蛋白质纯化虽然很复杂，但是本身并不是那么高不可攀。只要用心去揣摩和尝试，就一定可以做得很好。
　　
除了１３天的课程，写这一系列学习笔记，也让我收获不小。因为写的过程中，我认真的复习了所做实验的记录和课程的教材，对实验设计的理解加深了好多。这也算是除了在BBS上灌水外的一个意外收获吧。

有网友在版上问，“本文献给YL”中的YL是不是杨澜，答案是否定的。因为杨澜显然不懂生物，更不懂蛋白质纯化，^_^ 。YL是我的一个好朋友。课程还没结束的时候，我有一次打电话向她吹嘘我学到的新知识，并且夸口说会在MITBBS生物版写一些总结。然后她称赞我，说善于总结是我的优点云云。听到这些话，我心里有些飘飘然，因为我不常听到超极大美女的夸奖。可是很快，我就意识到不能光说不练，蒙混过关，所以只好咬着牙硬着头皮一点一点的挣扎的写到现在。所以，没有YL的鼓励，就没有这一系列文章。把这个系列献给她，算是表达我的感谢把。

最后，如果有同学对蛋白质纯化十分感兴趣，我在此推荐两本参考书。一本是我们这个课程的教材 Strategies for protein purification and characterization: a laboratory course manual . Cold Spring Harbor laboratory Press.另一本是Methods in Enzymology. Vol 182, Guide to Protein purification Academic Press. （全文完）